신델라(CINDELA) 암치료 모식도. IBS 연구진은 암 특이적 삽입/결실(InDel) 돌연변이를 표적하는 CRISPR-Cas9 유전자 가위를 제작해 암세포와 정상세포에 투입, 암세포 돌연변이의 DNA 이중 나선을 잘라내 암세포만을 사멸시키는 데 성공했다.
국내 연구진이 늙고 병든 질병 세포의 유전자만을 겨냥해 치료할 수 있는 '유전자가위시스템(CRISPR-Cas9)'을 개발해 병든 유전자 치료에 새로운 전기를 마련했다.
의학계는 정상 세포와 질병 세포가 혼합돼 있는 실제 환자에게도 효과적인 유전자 교정치료를 진행할 수 있을 것으로 기대하고 있다.
KAIST는 이지민 의과학대학원 교수팀이 오승자 한국과학기술연구원(KIST) 선임연구원, 이주용 강원대 교수와 공동연구를 통해 질병 세포의 유전자만 교정하는 유전자가위시스템(CRISPR-Cas9)을 개발했다고 밝혔다.
유전자가위시스템은 유전자를 정교하게 교정하는 매우 효과적인 도구다. 하지만 표적으로 삼은 유전자나 세포가 아닌 다른 유전자나 세포를 교정하는 문제가 있다.
연구팀은 유전자가위시스템인 크리스퍼 캐스9에 질병 세포가 인식할 수 있는 특정 염기서열을 삽입했다. 이 염기서열은 질병 세포가 생성하는 마이크로 리보핵산(RNA)에 특이적으로 절단된다.
이렇게 설계된 시스템은 정상 세포에서는 세포질에 머물러 유전자 교정을 수행하지 않지만, 질병 세포에서는 새로 삽입한 염기서열이 잘리며 세포핵으로 들어가 유전자 교정을 수행할 수 있다.
연구팀은 다양한 폐암세포에 이 시스템을 적용했다. 연구팀은 우선 ‘Ezh2’란 발암 단백질이 생성될 때 ‘마이크로RNA-21’이 과발현된다는 것을 증명했다.
연구팀이 폐암 세포에 새로 개발한 유전자 시스템을 적용한 결과 Ezh2의 유전자가 성공적으로 교정됐다. 연구팀은 또 유전자 교정 시스템과 항암 약물을 병행 사용할 때 폐암 세포의 성장이 더 효과적으로 억제된다는 사실을 규명했다.
암세포는 항암 약물에 지속 노출되면 약물 저항성을 획득한다. 연구팀은 쥐 실험을 통해 Ezh2와 마이크로RNA-21이 항암 약물인 시스플라틴을 투여하면 오히려 증가하는 것을 확인했다.
마이크로RNA는 유전자 전사 후 조절하는 19~24 뉴클레오티드(DNA나 RNA의 기본 단위) 길이의 RNA다. 마이크로RNA는 DNA로부터 전사된 메신저 RNA에 아르고너트(Argonaute) 단백질을 통해 결합하며 결합한 메신저 RNA를 절단한다.
다만 새로 개발한 유전자 시스템을 함께 적용하면 Ezh2가 억제돼 폐암 세포 성장이 더욱 효과적으로 억제됐다.
이번 연구결과는 국제학술지 '뉴클레익 엑시드 리서치(Nucleic Acids Research, IF 16.971)' 온라인판에 지난 5월30일자로 먼저 게재됐다.
논문제목은 'Cytosolic microRNA-inducible nuclear translocation of Cas9 protein for disease-specific genome modification'이다.
유전자가위시스템(CRISPR-Cas9)
CRISPR-Cas9 시스템이 목표 DNA 서열을 자르는 데에는 크게 4 단계를 거쳐 이뤄진다. 첫째, DNA 감시 복합체(DNA surveillance complex) 형성이다. 세포 내에서 Cas9 단백질과 crRNA가 발현되면 목표 DNA 서열을 찾기 위한 복합체를 형성한다.
사실 Cas9와 crRNA가 복합체를 이루기 위해선 tracrRNA라 불리는 RNA 조각이 추가적으로 발현되어 crRNA 내 반복 서열과 상보적인 결합(crRNA-tracrRNA duplex)을 이룬 상태여야만 한다. 하지만 crRNA와 tracrRNA의 말단을 서로 연결해 하나의 단일 RNA(single guide RNA, sgRNA)로 만들어 발현시켜도 정상적으로 크리스퍼 시스템이 작동하므로 실험실에서는 주로 sgRNA를 사용한다.
둘째, 목표 서열 인식이다. 목표 DNA를 인식하는 sgRNA의 서열은 약 20-nt로, 전체 유전체에서 이와 상보적인 서열이 있을 확률은 1/4^20이다. 이때 무작정 sgRNA와 DNA가 상보적인 결합을 한다고 해서 Cas9이 활성을 가지는 것이 아니라, Cas9은 sgRNA가 상보적으로 결합하는 DNA 서열 근처에 ‘PAM(Protospacer-Adjacent Motif)’라 하는 염기 서열이 있어야만 활성을 가질 수 있다.
셋째, 목표 서열 절단이다. Cas9 단백질에는 HNH와 RuvC라는 두 개의 뉴클레이스(nuclease) 도메인을 가지고 있는데, 목표로 하는 DNA 서열에 Cas9이 결합하면 이 두 도메인이 목표 DNA의 이중 가닥을 각각 한 가닥씩 자르게 된다.
넷째, DNA 수선이다. 절단된 DNA는 DNA 수선(DNA repair)이라는 기작을 통해 편집이 이뤄진다. 절단된 부위를 단순히 이어붙이는 비상동말단결합(Nonhomologous end joining, NHEJ) 기작으로는 유전자를 녹아웃시킬 수 있고, 상동 재조합(Homologous recombination)의 얼개인 동형방식수선(Homology Directed Repair, HDR)을 통해 유전자를 교정하거나 삽입할 수도 있다.
이와 같은 크리스퍼 기술은 생산은 물론 활용도 간단해 작은 연구실에서도 생산할 수 있다. 당시 유전체 편집 기술의 단점으로 꼽히던 자원집약적 특성[5]에서 벗어났기 때문에 더 많은 연구실들이 유전자가위에 접근할 수 있고 이로인해 세계 과학의 경쟁면에서 공정성이 상당히 높아지는 효과를 기대할 수 있다고 한다.
이런 유전체 편집 기술은 무엇보다도 원하는 목표 DNA 서열만 자르는, 다시 말해 엉뚱한 데를 자르는 ‘off-target’을 줄이는 것이 매우 중요하므로, RNA 서열을 바꿔보거나, Cas9 단백질 외 다른 단백질을 사용해보는 등 크리스퍼 시스템의 정확도를 높이고자 하는 연구가 많이 이뤄지고 있다.
